離子交換樹脂命名 ● ● ● ×● 離子交換樹脂命名 ?強(qiáng)酸性 （001-099） ?弱酸性（100-199） ?強(qiáng)堿性 （200-299) ?弱堿性 （300-399）
（3）大小及形狀：制成球形，其直徑為0.2-1.2mm。球形的優(yōu)點(diǎn)是增大比表面積、提高機(jī)械強(qiáng)度和減少流體阻力。
（4）色澤：普通凝膠型樹脂是透明的球珠，大孔樹脂呈不透明的霧狀球珠。隨合成原料、工藝條件不同，樹脂的顏色也有所不同，一般有黃、白、黃褐、紅棕等幾種顏色。
動(dòng)態(tài)：離子交換柱，交換、洗脫、再生等步驟均在柱內(nèi)進(jìn)行，亦稱為離子交換層析法, 操作連續(xù)、交換完全，適宜多組份分離
柱式固定床（Fixed－Bed） 模擬移動(dòng)床（SMB） 離子交換操作步驟 1 樹脂的選擇 2 樹脂預(yù)處理 3 裝柱
4 離子交換吸附 5 洗脫 6 再生
1 樹脂的選擇
2 樹脂預(yù)處理
物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒； 化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型
陽離子樹脂 酸—堿—酸 陰離子樹脂 堿—酸—堿
**后以去離子水或緩沖液平衡
3 離子交換吸附
? 溶液中待交換離子與樹脂上的活性離子發(fā)生交換反應(yīng)的過程 ? 使盡可能多的待交換離子吸附到樹脂上，同時(shí)保證其選擇性
4 洗脫
離子交換完成后，將樹脂吸附的物質(zhì)重新轉(zhuǎn)入溶液的方法 洗脫條件選擇原則
? （1） 與吸附條件相反 ? （2） 緩沖液 ? （3） 緩和酸堿 ? （4） 有機(jī)溶劑
洗脫一般采取梯度淋洗：先采用洗脫能力弱的溶液，使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更強(qiáng)的溶液，洗脫較難洗脫的組分。
5 樹脂再生
離子交換樹脂(IONRESIN)使用一段時(shí)間后，吸附的雜質(zhì)接近飽和狀態(tài)，就要進(jìn)行再生處理，使之恢復(fù)原來的組成和性能
樹脂的再生特性與它的類型和結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。
?強(qiáng)酸/強(qiáng)堿樹脂再生比較困難，再生劑量比理論值高相當(dāng)多； ?弱酸/弱堿性樹脂則較易再生，再生劑量只需稍多于理論值。
?大孔型和交聯(lián)度低的樹脂較易再生，而凝膠型和交聯(lián)度高的樹脂則要較長的再生反應(yīng)時(shí)
間。
?在實(shí)際運(yùn)用中，為降低再生費(fèi)用，使樹脂的性能恢復(fù)70～80%。再生劑的種類應(yīng)根據(jù)樹脂的離子類型來選用，并適當(dāng)?shù)剡x擇價(jià)格較低的酸、堿或鹽。
?鈉型陽樹脂可用NaCl溶液再生，用量為其交換容量的2倍 ； ?氫型陽樹脂用強(qiáng)酸再生，鹽酸或硫酸
?氯型堿性樹脂，主要以NaCl 溶液來再生，但加入少量堿有助于將樹脂吸附的色素和有
機(jī)物溶解洗出。 #p#分頁標(biāo)題#e#
?OH型堿陰樹脂則用4%NaOH溶液再生。
腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程 腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程
第五節(jié) 凝膠柱層析
利用凝膠層析介質(zhì)(固定相)交聯(lián)度的同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。
一、凝膠層析的原理
固定相（凝膠）是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于凝膠顆粒之外，因而具分子篩的性質(zhì)。又因整個(gè)層析過程一般不變換洗脫液，好像過濾一樣，故也稱凝膠過濾。
二、凝膠的種類 1.葡聚糖凝膠 2.瓊脂糖凝膠 3.聚丙烯酰胺凝膠
三、凝膠柱層析的操作與應(yīng)用
（一）凝膠柱層析的操作特點(diǎn) 1、凝膠柱層析優(yōu)點(diǎn)：（1）分離條件溫和，因此不易引起生物樣品的變性失活；（2）每次分離操作之后，層析劑無需再生就可重復(fù)利用；（3）工作范圍廣，分離的分子質(zhì)量范圍可從幾百到數(shù)百萬；（4）設(shè)備簡單，分離機(jī)理簡單，易于操作；（5）樣品回收率高，幾乎可達(dá)100%。 2、凝膠層析的缺點(diǎn)：凝膠層析上樣量小，操作壓力不能高，流速較慢。
（二）凝膠柱層析的特點(diǎn)與應(yīng)用 （1）主要用于脫鹽 （2）類分離 （3）分級(jí)分離
（4）生物大分子分子量的測定
第六節(jié) 疏水層析(hydrophobic chromatography) 利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法，稱之為疏水層析。 一、疏水層析的原理
親水性蛋白質(zhì)（酶）表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)。盡管在水溶液中蛋白質(zhì)（酶）具有將疏水性基團(tuán)折疊在分子內(nèi)部而表面顯露極性和荷電基團(tuán)的趨勢，但總會(huì)有一些疏水性基團(tuán)或極性基團(tuán)的疏水部位暴露在蛋白質(zhì)（酶）表面。這部分疏水基團(tuán)可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基會(huì)發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。
二、疏水性吸附劑
各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
三、疏水柱層析的操作與應(yīng)用
（一）疏水柱層析的操作特點(diǎn) 1、層析柱的制備 2、平衡
3、加樣與洗脫 4、再生
（二）疏水柱層析的特點(diǎn)與應(yīng)用 1、疏水柱層析特點(diǎn)：（1）疏水柱層析可直接分離鹽析后或高鹽洗脫下來的蛋白質(zhì)、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加樣量大；（3）疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。
2、疏水柱層析應(yīng)用：疏水柱層析適用于分離的任何階段，尤其是樣品離子強(qiáng)度高時(shí)，即在鹽析、離子交換或親和層析之后用。疏水柱層析主要用于蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化。
第七節(jié) 親和層析(affinity chromatography)
在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基這些配基可以與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為親和層析
親和柱層析的原理 一、親和柱層析的原理
（一）配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；
（二）吸附樣品：親和吸附介質(zhì)選擇性吸附酶或其他生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；
（三）樣品解析：選擇適宜的條件，使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其他生物活性物質(zhì)解吸
二、親和吸附介質(zhì)
用于親和層析的理想載體常選用均一的珠狀顆粒，特別是瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖，但也用合成的聚丙烯酰胺凝膠、纖維素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。 選作配基的分子必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，該基團(tuán)不參與配基與生物分子的特異結(jié)合，但是
卻可以用來連接配基與載體。
將親和配基共價(jià)偶聯(lián)在載體的表面，即可制得親和吸附介質(zhì)。一般凝膠過濾介質(zhì)均可作為親和配基的載體來制備親和吸附介質(zhì)。
三、親和柱層析的操作與應(yīng)用
?（一）親和柱層析的操作特點(diǎn)
1．基本過程 （1）進(jìn)料吸附 （2）雜質(zhì)清洗 （3）目標(biāo)產(chǎn)物洗脫 （4）層析柱再生
（二）親和層析的特點(diǎn)與應(yīng)用 #p#分頁標(biāo)題#e#
1、親和層析的特點(diǎn)：在生物制品分離和分析*域有寬廣的應(yīng)用開發(fā)前景。由于其具有簡便、快速、專一和高效等特點(diǎn)，親和層析的應(yīng)用十分廣泛，已普及到生命科學(xué)的各個(gè)*域。 2、親和層析親和層析的應(yīng)用： （1）分離和純化各種生物分子 （2）分離純化各種功能細(xì)胞
（3）用于各種生化成分的分析檢測
第八節(jié) 分配柱層析
一、分配柱層析的基本原理
分配柱層析是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分配系數(shù)不同而使混合物得到分離。
固定在柱內(nèi)的液體叫固定相，用作沖洗的液體叫流動(dòng)相。為了使固定相固定在柱內(nèi)，需要有一種固體來吸牢它，這種固體本身不起什么分離作用，也沒有吸附能力，只是用來使固定相停留在柱內(nèi)，這種固體叫載體。
進(jìn)行分離時(shí)先將含有固定相的載體裝在柱內(nèi)，加少量被分離的溶液后，用適當(dāng)溶劑進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中，流動(dòng)相與固定相發(fā)生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動(dòng)的速度不同，容易溶于流動(dòng)相中的成分移動(dòng)快，而在固定相中溶解度大的成分移動(dòng)就慢，因此得到分離。
二、分配柱層析的載體
（一）硅膠
吸水量為50%時(shí)仍為粉末狀，當(dāng)其吸水量在17%以上時(shí)，硅膠就失去其吸附作用，作為載體使用，此時(shí)硅膠層析則為分配層析。 （二）硅藻土
具有微孔結(jié)構(gòu)，不具吸附作用，是現(xiàn)在使用**多的載體。其處理和裝柱方法基本同硅膠相似 。
（三）纖維素
三、分配柱層析的固定相與展開劑 （一）固定相
常用的固定相有水、各種緩沖溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及為水所飽和的有機(jī)溶劑等。有時(shí)也采用¡°反相層析法¡±，即用有機(jī)溶劑為固定相，而以水或水溶液或與水混合的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。 （二）展開劑
流動(dòng)相一般用為水所飽和的有機(jī)溶劑或水一有機(jī)溶劑互溶的混合液，一般常用的流動(dòng)相溶劑有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯類等，或它們的混合物。反相層析法常用的流動(dòng)相，則為正相層析法中的固定相，如水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽與緩沖液）、低級(jí)醇類等。
三、分配柱層析的基本操作 （一）裝柱
裝柱前，將固定相與載體混合，如果用硅膠、纖維素等載體時(shí)，可以直加固定相直接混合，用硅藻土為載體先把硅藻土放在大量流動(dòng)相液體中，在不斷攪拌下，逐漸加入固定相。 （二）加樣
?1、將被分離物配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加到含固定相載體的上端，然后加流動(dòng)相洗脫；
?2、被分離物溶液用少量含固定相的載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在層析管載體的上端，然后加流動(dòng)相洗脫；
?3、用一塊比管徑略小的圓形濾紙吸附被分離物溶液，溶劑揮發(fā)后，放在載體上，然后加流動(dòng)相洗脫。
四、分配柱層析的特點(diǎn)與應(yīng)用
（一）特點(diǎn)：
分配柱層析具有載體來源容易、分離成本低、流速快等特點(diǎn),適用于分離極性比較大、在有機(jī)溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。 （二）應(yīng)用：
分配柱層析多用于分離親水性的成分，如苷類、糖及氨基酸類。
實(shí)驗(yàn)十 胡蘿卜素的柱層析分離 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（一）實(shí)驗(yàn)原理及目的 1、原理
本實(shí)驗(yàn)采用氧化鋁為固定相的吸附層析。各種物質(zhì)具有不同的吸附力， 胡蘿卜素存在于胡蘿卜、辣椒等黃綠色植物中，由于在動(dòng)物體內(nèi)可將胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，故又稱維生素A原。胡蘿卜素（屬多烯色素類，又可分為α、β、γ等幾種類型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有機(jī)溶劑從食物中提取出來，并能被氧化鋁所吸附。由于胡蘿卜素與其他植物色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度以及被氧化鋁吸附的強(qiáng)度也不相同，故將抽提液進(jìn)行氧化鋁柱層析，再用石油醚等沖洗層析柱，即可將植物提取液中混合的胡蘿卜素分離成不同的色帶。同植物其他色素相比較，胡蘿卜素的極性**小，吸附**差，用石油醚洗脫速度**快，故被**先洗脫下來，使胡蘿卜素與其他色素分開。同時(shí)也可將胡蘿卜素層析帶洗脫下來進(jìn)行比色定量。
2、目的
（1）了解柱層析的基本原理
（2）掌握胡蘿卜素分離的操作方法 （二）試劑及器具 1、材料
新鮮紅辣椒、氧化鋁（Al2O3，高溫烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、試劑
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95%乙醇、無水硫酸鈉、石油醚（沸點(diǎn)60～90℃）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；體積比）、三氯化銻氯仿溶液（稱取三氯化銻22g，加100ml氯仿溶解后，貯于棕色瓶中）。 3、器具
剪刀、研缽，層析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，鐵架臺(tái)及蝶形夾，蒸發(fā)皿，恒溫水浴，天平，燒杯、軟木塞、棉花、膠頭滴管、濾紙、試管 二、實(shí)驗(yàn)過程
乙醇 石油醚 蒸餾水 硫酸鈉
紅辣椒 研磨 研磨 洗滌 提取液 除水 上樣 層析 收集洗脫液 鑒別 三、注意事項(xiàng)
（一）實(shí)驗(yàn)中一定要將新鮮紅辣椒研細(xì)，以徹底破壞植物細(xì)胞，使胡蘿卜素釋放更完全。丙酮可增強(qiáng)分離效果，有利于對(duì)胡蘿卜素的提取，若分離條件控制得好，可依次提取、分離得到α胡蘿卜素，ß胡蘿卜素、γ胡蘿卜素，以及緊隨其后的是辣椒紅素，番茄紅素及葉黃素等植物色素。
（二）為使分離色帶整齊，裝柱時(shí)層析柱一定要無裂縫和氣泡，氧化鋁的高度一般為玻璃柱高度的3/4，裝好柱后柱上面覆一層濾紙，以保持柱上端頂部平整，若上端不平，影響分離效果而產(chǎn)生不規(guī)則的條帶。
三）分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個(gè)操作中jue不能使氧化鋁表面的液體流干。
（四）三氯化銻腐蝕性較強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)過程中切勿觸及皮膚。三氯化銻遇水生成堿式鹽，再轉(zhuǎn)變成氯氧化銻，此化合物與胡蘿卜素不發(fā)生顏色反應(yīng)，而出現(xiàn)渾濁。
（五）石油醚提取液中的乙醇必須洗凈，否則吸附不好，層析中色帶也彌散不清。 （六）層析柱底部棉花的用量不宜過多，松緊要適宜，否則將影響流速。
實(shí)驗(yàn)十一 離子交換色譜分離混合氨基酸 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（一）實(shí)驗(yàn)原理及目的 1、原理
本實(shí)驗(yàn)采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因?yàn)閜H值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH=12條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。2、目的
(1)、了解離子交換樹脂分離氨基酸基本原理 (2)、掌握陽離子交換樹脂處理技
（二）試劑及器具 1、材料
磺酸型陽離子交換樹脂（732型） 2、試劑
樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。 3、器具
離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、
恒流泵。 二、實(shí)驗(yàn)過程
樹脂處理、轉(zhuǎn)型 裝柱 平衡 上樣 洗脫 收集 測定
三、注意事項(xiàng)
（一）為使分離色帶整齊，裝柱時(shí)層析柱一定要無裂縫和氣泡。
（二）分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個(gè)操作中jue不能使樹脂表面的液體流干。
（三）一直保持流速10滴/min～12滴/ min，并注意勿使樹脂表面干燥。
實(shí)驗(yàn)十二 凝膠柱層析分離蛋白質(zhì) 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（一）實(shí)驗(yàn)原理及目的 1、原理： 凝膠層析（gel chromatography）是利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進(jìn)行分離的技術(shù)。當(dāng)溶液在層析柱內(nèi)流過時(shí)，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行向下的移動(dòng)和不定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，難于進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能在凝膠顆粒的間隙中隨流動(dòng)相快速向下移動(dòng)；而小分子物質(zhì)能夠擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，因此在流動(dòng)過程中不斷地進(jìn)出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度落后于大分子物質(zhì)，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小的順序先后流出層析柱，達(dá)到分離純化的目的。 #p#分頁標(biāo)題#e#
本實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠柱層析分離（凝膠過濾）的基本操作技術(shù)環(huán)節(jié)，如柱層析填充介質(zhì)（凝膠）的溶脹、裝柱、平衡、洗脫等。
?2、目的：
（1）熟悉凝膠層析分離的基本原理；
（2）掌握凝膠柱層析填充物的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術(shù) ?（二）試劑及器具 1、材料 Sephadex G-50（或G-75）、藍(lán)色葡聚糖2000、牛血清蛋白 2、試劑
磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。
緩沖液的配制方法：先稱取一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀，用去離 子水分別溶解、配制成3L濃度為0.1mol/L的溶液，然后將這兩種溶液邊按一定比例混合，邊用酸度計(jì)檢測，調(diào)配成pH7.0的磷酸鹽緩沖液 3、器具
酸度計(jì)、層析柱（1.6cm×30cm）、鐵架臺(tái)、試管（多個(gè)）紫外分光光度計(jì)或
紫外檢測儀、電爐、容量瓶（1L）、燒杯、三角瓶、滴管、移液管、電子天平、玻棒、塑料壺（3~5L）。 二、實(shí)驗(yàn)過程
凝膠溶脹 裝柱 平衡 加樣 洗脫 繪制曲線 三、注意事項(xiàng) ?（一）層析柱大小可根據(jù)實(shí)際需要選擇，一般來說，細(xì)長的柱分離效果較好。若樣品量多，**好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生管壁效應(yīng)，即柱管中心部分的組分移動(dòng)慢，而管壁周圍的移動(dòng)快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
?（二）裝好的層析柱凝膠要均勻，不能有斷層或紋路或氣泡，將柱管對(duì)著光照方向觀察，若層析柱床不均勻，必須重新裝柱。
?（三）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。
?（四）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致分離效果變差，不得不重新裝柱。 ?（五）洗脫用的液體應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果。
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