一、目的 

了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。  

二、原理 

以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機(jī)溶劑組成。展層時(shí)，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強(qiáng)；有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，它與濾紙纖維親和力弱。有機(jī)溶劑在濾紙上又下向上移動(dòng)的，稱為上行法；有上向下移動(dòng)的，稱為下行法。 

將樣品在濾紙上確定的原點(diǎn)處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進(jìn)行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來(lái)，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動(dòng)速率（Rf值） 

Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 

用混合氨基酸做樣品時(shí)，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動(dòng)速率相同或相近，就不能將它們分開，為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以**次所的層析點(diǎn)為原點(diǎn)，在用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇ā?nbsp;

本試驗(yàn)主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。 

 

三、實(shí)驗(yàn)儀器    1、 新華濾紙    2、 層析缸    3、 細(xì)線    4、 點(diǎn)樣管    5、 橡皮筋    6、 電吹風(fēng)    7、 噴霧器  

四、實(shí)驗(yàn)試劑 

1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液 2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—無(wú)水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無(wú)水丙酮，貯于棕色瓶中  

 

五、試驗(yàn)步驟  

1、取濾紙剪成20×10厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細(xì)線，在另一端2~3cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點(diǎn)（原點(diǎn)）。 

2、取毛細(xì)管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原點(diǎn)處點(diǎn)樣，樣點(diǎn)直徑不宜超過(guò)5mm,每點(diǎn)一次用吹風(fēng)機(jī)吹干，點(diǎn)2~3次為佳。 

   3、點(diǎn)樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點(diǎn)樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，當(dāng)展層**另一端1~2cm處時(shí)，停止展層（大約2~3小時(shí)）。    4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風(fēng)吹干（或烘箱60℃）烘干。    5、均勻噴上茚三酮—無(wú)水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。    6、用吹風(fēng)機(jī)吹干，觀察層析點(diǎn)，確定其幾何中心。 

   7、量取數(shù)值，計(jì)算各自的Rf值，與表中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。（書上圖譜橫著看） 

 

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 

1.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸單向上行層析法 定性、定量測(cè)定： 

將樣品在濾紙上確定的原點(diǎn)處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進(jìn)行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來(lái)，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。 

甘氨酸層析點(diǎn)中心到原點(diǎn)的距離：0.4cm 苯丙氨酸層析點(diǎn)中心到原點(diǎn)的距離：3.2cm 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離:10.8cm 

在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動(dòng)速率（Rf值） 

Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037 Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296