一、
實驗目的
① 、提取葉綠體色素 ② 、對葉綠體色素進行紙層析 二、
實驗原理
紙層析：是層析中**簡便的一種。一般的被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解的紙層析屬于分配層析，它實際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，以有機溶劑為流動相，當流動相沿紙經(jīng)過樣品時，樣品點上的溶質(zhì)在水和有機相之間不斷進行分配，一部分樣品隨流動相移動，進入無溶質(zhì)區(qū)，此時又重新分配，一部分溶質(zhì)由流動相進入固定相（水相）。隨著流動相的不斷移動，各種不同的部分按其各自的分配系數(shù)不斷進行分配，并沿著流動相移動，從而使物質(zhì)得到分離和提純。當層析溶劑不斷從紙上流過時,由于混合物(葉綠素提取液)中各種成分在固定相和流動相間溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后,可將各種色素分開。
研缽，漏斗，凍存管，剪刀，滴管, 濾紙，脫脂棉（或尼龍布或紗布），毛細管，吸水紙。
藥品試劑：①無水乙醇和丙酮；②石英砂；③碳酸鈣；④層析液：石油醚10ml+丙酮2ml+苯1ml. 四、
實驗步驟
1.葉綠體色素的提取
(1)取植物新鮮葉片2 g,洗凈,擦干,去掉粗的葉脈，剪碎,放入研缽中； (2)研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉, 研磨**近乎糊狀，加入10-15mL 無水乙醇,再研磨片刻，提取3-5 min，然后用漏斗（內(nèi)放一層薄的脫脂棉）過濾,即得色素提取液。 2.葉綠體色素的分離
(1)制備濾紙條：剪去一端兩角，在距離剪角一端1～ 1.5 cm處用鉛筆畫線（或簡單做個記號）。
(2) 畫濾液細線：用毛細吸管吸收少量濾液，沿鉛筆線（記號）處均勻地畫一條直的濾液細線。干燥后，連續(xù)重復3～5次，**濾液細線呈綠色。 (3)分離色素：倒入層析凍存管2～3 ml層析液，適當調(diào)節(jié)層析液液面，以放入濾紙條后樣品線**少稍稍高出濾液為宜。以將濾紙條**朝下略微斜靠燒杯內(nèi)壁，輕輕插入層析液，旋緊蓋子 3.（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），
在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。
另取一張濾紙條（5cm×1.5cm），用毛細管吸取葉綠體色素提取液沿紙條的長度方向涂在紙條的一邊，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，風干后，再重復操作數(shù)次，然后沿長度方向卷成紙捻，使浸過葉綠體色素溶液的一側(cè)恰在紙捻的一端。
（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿凸出）。
（3）在9cm培養(yǎng)皿內(nèi)放一3cm培養(yǎng)皿，在3cm培養(yǎng)皿中央小室中加入適量的推動劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。此時，推動劑借毛細管引力順紙捻擴散**圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。
所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應相同，且略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。
（4）當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風干，即可看到分離的各種色素，用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。
五、 實驗結(jié)果
六、
實驗結(jié)論
當推動劑前沿接近濾紙上端邊緣時，取出濾紙，自然晾干，觀察色帶的分布：四種色素在濾紙上的移動速度是胡蘿卜素(橙黃色)>葉黃素(黃色)>葉綠素a(藍綠色)>葉綠素b(黃綠色)。 七、
實驗注意事項
1、材時要選取新鮮的顏色較深的葉片，是因為以便使濾液中含較多的色素；
2、研磨時加入石英砂的目的是為了研磨得充分，更有效地破壞細胞結(jié)構(gòu)；但由于二氧化硅粉是特別細的白色粉末，再加上控制不好用量，易過量，使濾液中含有較多的二氧化硅，而導致濾液顏色變淺。濾液中雜質(zhì)越多，實驗現(xiàn)象越不明顯。不要加太多！
3、入少許碳酸鈣的目的是為了防止在研磨過程中，葉綠素受到破壞。因為葉綠體分子結(jié)構(gòu)中含有一個鎂原子，當細胞破裂時，細胞液內(nèi)有機酸中的氫可取代鎂原子而成為褐色的去鎂葉綠素，碳酸鈣可中和有
機酸以防止去鎂反應的發(fā)生。
4、研磨要迅速、充分。這是因為一是因為提取液容易揮發(fā)；二是為了使葉綠體完全破裂，從而能提取較多的色素；三是葉綠素極不穩(wěn)定，能被活細胞中的葉綠素酶水解而破壞。迅速和充分是存在著一定沖突的兩種要求，在實驗中，可采用先不加提取液，研磨幾分鐘后再加入提取液。
5、制備濾紙條時，根據(jù)邊緣擴散原理，物質(zhì)分子沿邊緣擴散速度要大于里邊擴散的速度，因此要將濾紙條的一端剪去兩角，主要是為了延長邊緣長度，這樣可以使色素在濾紙條上擴散均勻，便于觀察實驗結(jié)果。
6、畫線時，一定要細并且直，這樣可以防止色素帶重疊，使色素分子均勻分布在一條直線上，做到擴散起點一致。重復劃2-3次，是為了增加濾液細線上的色素分子數(shù)量，使實驗效果更加明顯。 7、分離色素時，一定不要讓濾紙條上的濾液細線沒及到層析液，這是因為色素易溶解于層析液中，導致色素帶不清晰，影響實驗效果。 分離色素用的圓形濾紙，在中心打的小圓孔，周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個同心圓 #p#分頁標題#e#
八、
問題與解答
1、濾液細線為什么要畫直，要畫幾次？
答：就是為了防止色素帶的重疊；增加色素量，使色素帶的顏色更深一些。
2、為什么要在研磨時加碳酸鈣和二氧化硅？
答：加二氧化硅是為了充分研磨，加碳酸鈣是為了保護葉綠體色素。
