柱層析的基本操作
柱層析的基本操作
柱層析的基本操作包括以下一些步驟： ⑴ 裝柱
柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
shou先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長(zhǎng)度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時(shí)將柱子洗滌干凈。
將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當(dāng)濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。
關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約高。
打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
**后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~高的緩沖液，同時(shí)關(guān)閉出水口。（采用機(jī)械化裝柱法在此省略。） ⑵ 平衡
柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用
恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時(shí)柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。 ⑶ 加樣
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對(duì)于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當(dāng)然，**大加樣量必須在具體條件下多次試驗(yàn)后才能決定。
應(yīng)注意的是，加樣時(shí)應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。詳細(xì)操作見層析實(shí)驗(yàn)。 ⑷ 洗脫
當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
簡(jiǎn)單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔（或洗脫體積間隔）也不長(zhǎng)，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。
分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。它主要對(duì)混合物組成簡(jiǎn)單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時(shí)適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。**常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度?？尚纬商荻鹊男问接腥N，如圖3－4 所示（以鹽濃度梯度為例）：
我們可以通過下式計(jì)算得到流經(jīng)層析柱的洗脫液中鹽濃度的計(jì)算公式：
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中： C ：流經(jīng)層析柱的洗脫液的鹽濃度 CB ：
梯度混合器中B 瓶的鹽濃度（不攪拌） CA ：
梯度混合器中A 瓶的鹽濃度（攪拌） B1 ：B 瓶的橫切面積 A1 ：A 瓶的橫切面積
V2 ：流經(jīng)層析柱的洗脫液體積 V1 ：梯度洗脫液總體積
洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對(duì)所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時(shí)，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時(shí)還應(yīng)注意洗脫時(shí)的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實(shí)上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時(shí)間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗(yàn)才會(huì)得到合適的流速?？傊覀儽仨毥?jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整（可以用正交試驗(yàn)或優(yōu)選法），才能得到**佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，在整個(gè)洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會(huì)前功盡棄。 ⑸ 收集、鑒定及保存
在生化實(shí)驗(yàn)中，基本上我們都是采用
部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個(gè)純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低**0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個(gè)峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個(gè)蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對(duì)各管進(jìn)行鑒定。對(duì)于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對(duì)于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。**后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?/div>
